上皮间充质可塑性决定雌激素受体阳性乳腺癌休眠和上皮再转化驱动复发 - 自然通讯

ER+ 与 TN MIND 模型中的肿瘤生长和进展在

ER+ BC MIND 模型中,在临床相关的远处器官中检测到的 DTC 未能进展为大转移 13、14、17。为了确定该观察结果是否反映了 ER+ BCs 肿瘤休眠还是实验性伪影,我们通过 MIND 方法比较了 ER+ 和 ER- BC 细胞的转移行为。我们使用 TNBC 细胞系 BT20 和 HCC1806(表 1)以及源自未处理的原发性 TNBC 的 PDX,T70(表 2)对 ER-BC 建模。为了模拟 ER+ BC,我们使用了已建立的 ER+ 细胞系 MCF-7 和 T47D(表 1)和 2 个 ER+PR+HER2-PDX:T99 来自未经治疗的原发性肿瘤,METS15 来自晚期疾病患者的腹水。表 2)。所有肿瘤细胞都用表达 GFP-Luc2 或 RFP-Luc2 的慢病毒感染并注射到 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 雌性的乳管中(图 1a)14。摄取率,定义为显示体内肿瘤细胞生长的腺体相对于注射腺体总数的百分比,TNBC 为 100%,ER+ BC 异种移植物≥90%(图 1b)。在五周内,移植了 BT20、HCC1806 和 T70 的小鼠出现了可触及的乳腺肿瘤,生物发光增加了 702、592 和 1915 倍(图 1c、d),它们显示出发病迹象并被安乐死。在同一时间段内,来自 MCF-7、T47D、T99 和 METS15 异种移植物的生物发光分别仅增加了 42、39、54 和 5 倍(图 1c,d)。五个月后,生物发光增加了 1000 到 2000 倍,肿瘤变得明显,但宿主小鼠保持健康(图 1c,e)。

说明本研究中使用的导管内异种移植方法的方案。 Η&E: 苏木精 &伊红,IF:免疫荧光。 b 条形图显示导管内注射的 TN(蓝色)和 ER+(红色)BC 细胞的摄取率,每组注射 5-9 只小鼠的 13-19 个乳腺。垂直虚线表示 90%。 c 显示所有导管内异种移植物的生物发光倍数随时间变化的图表。数据代表每组 5-9 只小鼠的 13-19 个乳腺的平均值 ± SEM。虚线表示 TNBC 异种移植物的实验终点。 d 导管内注射后 5 周生物发光的倍数变化。数据代表每组 5 至 9 只小鼠的 13-19 个乳腺的平均值 ± SEM。蓝色和红色虚线分别代表 TN(1148 倍)和 ER+ BC(32 倍)的平均变化生物发光。相对于 MCF-7(对照)的单向 ANOVA、Kruskal-Wallis 检验。 e 箱形图显示了来自图 1c 的 TN(5 周)和 ER+(5-6 个月)BC 细胞在终点处生物发光的倍数变化。方框跨越第 25 到第 75 个百分位,胡须是四分位间距的 1.5 倍。箱线图须线显示最小值和最大值。双尾 Mann-Whitney 检验。 f、g 条形图分别显示来自 9、7 和 6 只携带 BT20、HCC1806 和 T70 异种移植物的小鼠的切除器官的离体生物发光,f 和 20、9、10 和 14 只携带 MCF-7、T47D、T99 的小鼠,METS15 异种移植物,分别,g 数据代表平均值±SEM。 h 点图显示肺中生物发光与原发性肿瘤的比率。数据代表 n = 9 (BT20)、7 (HCC1806)、12 (MCF-7)、8 (T47D)、3 (T99) 和 12 (METS15) 小鼠的平均值 ± SEM。蓝色和红色虚线分别代表 TN 和 ER + BC 细胞的平均比率。

来自 ER+ 和 TN BC 模型的切除器官的离体成像显示大脑、肺、肝脏和骨骼中的生物发光;来自肺中BT20和HCC1806细胞的信号特别高(图1f,g)。来自妊娠相关 BC 患者的 T70 细胞在肝脏中很容易检测到(图 1f),这与这些患者肝转移增加的临床报告一致。从携带 MCF-7、T47D 或 MET15 细胞的小鼠切除的肺和骨骼中的生物发光信号很高,而来自 T99 细胞的信号在 10 只小鼠中有 3 只略高于背景水平(图 1g),与之前的观察结果一致 13 .在各自的实验终点,原发性肿瘤负荷相当,但 TNBC 模型中肺的生物发光相对于乳腺的生物发光平均比 ER + BC 模型高 100 倍(图 1h)。因此,TNBC 异种移植小鼠的转移进展速度快于 ER+ 移植小鼠,这反映了临床观察到的 BC 转移亚型差异。

然后,我们通过用 BT20 和 HCC1806 细胞异种移植的乳腺的荧光立体显微镜检查早期肿瘤细胞播种。导管内注射一周后,GFP 信号局限于导管(补充图 1a,b),组织学检查证实肿瘤细胞位于导管内,这是人类疾病原位阶段的特征(补充图 1c, d)。没有检测到上皮 - 基质边界的破坏,但充满肿瘤细胞的导管周围的纤维细胞外基质(ECM)比没有人类细胞的导管周围更厚(补充图1c,d)。在这个阶段,10 只携带 BT20 的小鼠中有 5 只和 4 只携带 HCC1806 的小鼠中有 2 只肺的离体生物发光高于背景水平(补充图 1e)。植入两周后,在植入的乳腺中检测到多个侵入性病灶(补充图 1a-d)。在所有携带 BT20 和 HCC1806 的小鼠中,肺部显示出增加的生物发光(补充图 1e),并且通过荧光立体显微镜检测到 GFP+ 病变(补充图 1f)。因此,TN 和 ER+ BC 导管内异种移植物在临床研究中观察到的原位阶段传播19,20,但只有 TN DTC 进展为大转移。

ER+ 转移性病灶处于休眠状态

ER+ BC 模型中远处部位的生物发光缓慢增加表明处于休眠状态。因此,我们通过荧光立体显微镜和随后的组织学分析分析了肺中的 DTC。 BT20 和 HCC1806 细胞都产生了病变,这些病变很容易通过荧光立体显微镜检测到,并且在组织学检查中测量到直径为 0.5-3.0 毫米(图 2a,b)。相比之下,由 MCF-7 和 T47D 导管内异种移植物引起的肺部病变几乎无法通过荧光立体显微镜检测到,直径仅为 10-100 µm(图 2a、c)。在 TN PDX 的情况下,肝脏病变的直径为 0.5-1.0 mm(图 2d)。两种方法均在肺中检测到 METS15 细胞(图 2e,f),但 T99 细胞既未通过荧光立体显微镜检测,也未通过随后筛选来自 3 只宿主小鼠肺叶的>40 个组织切片,与低生物发光(图1d)。

a 来自 ≥ 3 只具有 BT20、HCC1806、MCF-7 或 T47D 导管内异种移植物的小鼠肺部的代表性荧光立体显微照片,箭头指向 DTC。比例尺,1 毫米。 b、c 来自 3 只携带 BT20 和 HCC1806 (b) 或 MCF-7 和 T47D (c) 导管内异种移植物的小鼠的 H&E 染色肺切片的代表性显微照片。比例尺,50 µm。 d, e 来自≥3 只携带 T70 和 METS15 MIND 异种移植物的小鼠的肝脏 (d) 和肺 (e) 的代表性荧光立体显微照片。比例尺,1 毫米。 f 来自携带 METS15 导管内异种移植物的 3 只小鼠的 H&E 染色肺切片的代表性显微照片。比例尺,50 µm。 g 在导管内注射 BT20 和 HCC1806 细胞 5 周后,小鼠匹配的原发性切片和肺切片中 Ki67+ 细胞的百分比,n ≥ 14 个切片。 h 条形图显示不同大小的 BT20 和 HCC1806 肺部病变的 Ki67 指数。 i 如图所示,在导管内注射 MCF-7、T47D 和 METS15 细胞 5 个月后,小鼠匹配的原发性肿瘤和肺切片中的 Ki67+ 指数。在 g 和 i 中,每个数据点代表 ≥ 1,000 和 100 个分析的细胞,分别来自 ≥ 3 只小鼠/条件的平均值 ± SD。 g-h 数据代表来自 3 个不同主机的平均值 ± SD。学生的非配对 t 检验,双尾。 j FUCCI 记者方案。 k 条形图显示携带 MCF-7 导管内异种移植物小鼠的原发性肿瘤和肺微转移中循环和非循环细胞的百分比。数据代表来自 3 只宿主小鼠的平均值 ± SD。配对 t 检验。 l 匹配的原发肿瘤(左)和肺(右)中 MCF-7:FUCCI 细胞的代表性荧光显微照片。比例尺,50 µm。 m 条形图显示肺中 p27+Ki67- 细胞占人体细胞总数的百分比。数据代表 n ≥ 3 只小鼠的平均值 ± SD,点代表分析的 ≥ 40 个细胞。单向方差分析。 n CK8(蓝色)、p27(洋红色)和 Ki67(青色)的代表性免疫荧光显微照片,在携带 MCF-7 的小鼠的肺切片上用 DAPI(灰色)复染。比例尺,50 µm;入口,20 µm。 *、***、****和ns代表P<;分别为 0.05、0.001、0.0001 和不显着。

接下来,我们量化了原发性和转移性病变的增殖指数(补充表 1)。 BT20 和 HCC1806 肺部病变的 Ki67 指数与原发性肿瘤的大小无关(图 2g,h,补充图 2a)。相比之下,ER+ 远处病灶中的 Ki67+ 指数平均仅为原发性肿瘤中的三分之一(图 2i 和补充图 2b)。

为了表征细胞周期动力学,我们使用了基于荧光泛素化的细胞周期指示剂 (FUCCI)21,它将非循环 (G0/G1) 细胞区分为红色荧光,将循环 (S-G2-M) 细胞区分为 GFP+ 或双阳性细胞(图 2j)。异种移植 MCF-7:FUCCI 小鼠中红色与绿色和黄色荧光细胞的评分显示,原发性肿瘤中 38.6% 的细胞处于 G0/G1 期,在匹配的肺中这一比例增加到 68.2% (P < 0.05)病变(图2k,l)。

为了测试休眠状态,我们用 p27、Ki67 和 CK8 共同免疫荧光标记肺。 p27 是休眠的标志物22,而 CK8 用于区分 DTC (CK8+) 与周围的小鼠肺泡细胞 (CK8LOW)。少于 1% 的 CK8+ TNBC 细胞是 p27+Ki67-,而超过 10% 的 ER+ BC 细胞是 p27+Ki67-(图 2m,n 和补充图 3a,b)。因此,作为静止和/或休眠状态的特征,很大一部分 ER+ DTC 在细胞周期的 G0/G1 期停滞。

DTC 具有上皮间充质可塑性 (EMP) 的特征

单个 ER+ 肺 DTC 出现间充质(图 3a),促使我们量化肿瘤细胞的细胞纵横比(CAR),作为长轴:短轴 23。一辆汽车&gt; 1.7 间充质细胞的特征 10-15% 的肿瘤细胞在原发部位图 3b 和 40-50% 的 DTC 在肺中(图 3c)。接下来,我们通过 IF 分析了 E-cad 的表达。 E-cad 蛋白在原代 ER+ BC 细胞中很容易检测到,但在匹配的肺 DTC 中信号强度降低至<10%,这是基于 CK8 表达鉴定的(图 3d 和补充图 4a-c)。我们对来自远处部位的荧光病变进行了显微解剖,并使用人类特异性引物通过实时 PCR (RT-PCR) 分析将它们的 mRNA 水平与相应原发性肿瘤的 mRNA 水平进行了比较。远处病灶中的 MKI67 和 CDH1 转录物水平显着低于原发性肿瘤(图 3e,f,补充图 4d)。 EMT转录因子(EMT-TFs)、ZEB1和ZEB2以及间充质中间丝VIM的转录水平在肺病变中显着高于原发性肿瘤(图3g,补充图4d)。 SNAI2 和 TWIST1 mRNA 水平在原发性肿瘤和转移性病灶之间没有差异,而 SNAI1 表达在 MCF-7 模型中的转移性病灶中下调(图 3g)。在 METS15 模型的原发性肿瘤或肺部病变中未检测到 CDH2、SNAI1、SNAI2 和 TWIST1 转录物。 ZEB1、ZEB2 和 VIM 转录物水平也在脑 DTC 中上调(图 3h)。在我们分离的 3 个肝脏病变中,VIM 转录物显着上调(P < 0.05),ZEB1 和 ZEB2 转录物水平呈上升趋势(分别为 P < 0.12 和 P < 0.25)(图 3i )。作为显微解剖的另一种方法,我们使用来自 METS15 异种移植小鼠的原发性肿瘤和肺组织进行了 qRT-PCR。与匹配的原发性肿瘤相比,观察到肺 DTC 中人类特异性基因表达水平的类似变化(补充图 4e)。

a 对宿主肺中 METS15 细胞的光学透明切片进行 CK8 染色。比例尺,10 µm。 b 代表关于形态的不同细胞纵横比 (CAR) 的代表性掩膜 c 具有 CAR 的细胞百分比 > 1.7 在匹配的原发性肿瘤和来自导管内 ER+BC 异种移植小鼠的肺中。数据代表平均值 ± SD,每个数据点代表来自 3 只小鼠的至少 100 个原代细胞和 10 个肺 DTC。配对学生 t 检验。 d 匹配的原发性肿瘤细胞和带有指示导管内异种移植物的小鼠的肺 DTC 中的相对 E-cad 强度 (Int.)。数据代表 n≥8 幅图像,来自 3 只小鼠的平均值 ± SD。学生 t 检验 e、f 在原发性肿瘤(8 只小鼠)或肺(n = 8)、脑(n = 4)和肝脏 (n = 3) DTC。数据代表平均值±SD。单向方差分析。 g–i 在匹配的 MCF-7 原发性肿瘤和肺 (gn = 8)、脑 (hn = 4) 和肝脏 (in = 3) DTC 中指示的 mRNA 的相对水平。威尔科克森试验。 j 来自 3 只小鼠的匹配的 BT20 或 HCC1806 原发性肿瘤和肺转移瘤中指示的 mRNA 的相对水平。配对 t 检验。 k 在导管内注射 BT20 或 HCC1806 细胞 3 周后,来自至少 3 只小鼠的肺部代表性荧光立体显微照片。箭头指向微转移。比例尺,1 毫米。 l.从至少 4 只携带 BT20(左)或 HCC1806(右)的小鼠中检索到的 3 与 5-6 周肺 DTC 中所选基因的相对 mRNA 水平,n ≥ 4。数据代表平均值 ± SD,Wilcoxon 检验。在面板 e-j 和 l 中将基因表达标准化为 GAPDH 和 HPRT 的几何平均值。 *、**、***、****和ns代表P<;分别为 0.05、0.01、0.001、0.0001 和不显着。

在 BT20 和 HCC1806 模型中,MKI67、CDH1、CDH2、ZEB1、SNAI1、SNAI2、VIM 和 TWIST1 转录水平在匹配的原发部位和具有大转移的肺之间具有可比性(图 3j),表明休眠不是TNBC 转移。为了确定 TN DTC 在成为大转移之前是否经过休眠状态,我们比较了 3 周时肺中上皮细胞和 EMP 标志物基因的表达水平,此时微转移占主导地位(图 3k),与 5-6在导管内注射 BT20 和 HCC1806 细胞后,检测到大转移数周。在两个时间点,在肺中观察到相似的 MKI67、CDH1、EPCAM 和 EMT-TF 和 VIM 表达水平(图 3l)。此外,增殖性 TNBC 细胞在原发性(补充图 4f)和远处部位处于可比较的 EMP 状态。因此,间充质形态和多种 EMP 标志物的表达是 ER+ DTC 特有的特征。

EMP 在 ER+ 肿瘤进展中的作用越来越多

的证据支持这样一种观点,即肿瘤细胞呈现不同的 EMP 状态,这对它们的侵袭和转移很重要24,25,26,27。为了评估 EMP 在 ER+ BC 从原位向侵袭阶段的转变过程中是否发生,我们测量了导管内注射 MCF-7 细胞 1 个月后原位肿瘤原位和 5 个月时 CDH1 和 EMT-TFs 的表达。它们是侵入性的(图 4a)。 CDH1、ZEB1 和 VIM 转录水平没有变化,而 ZEB2 表达减少,而 TWIST1 和 SNAI2 表达在侵袭阶段增加(图 4b)。 IF 显示 MCF-7 细胞在原位和侵袭性病变(图 4c)以及肿瘤出芽区域、侵袭性前沿和血管附近表达 E-cad 和 CK8 蛋白(补充图 3)。 5a-c)。因此,在我们的模型中,ER+ DTC 的 EMP 特征在主要部位不容易检测到。

a 原位和侵入性 MCF-7 导管内异种移植物的代表性 H&E 显微照片,比例尺,100 µm。 b 原位标记基因和侵入性MCF-7导管内异种移植物的相对mRNA水平。数据代表来自 3 只小鼠的 6 个腺体的平均值 ± SD,非参数 Mann-Whitney 测试。 c 原位和侵入性 MCF-7 导管内异种移植物的代表性 E-cad IF 显微照片,比例尺,50 µm;入口,10 µm。 d 导管内异种移植物中 MCF-7 shSCR 和 shCDH1 的倍数变化辐射,平均值 ± SEM,n = 19 或 20 只来自 5 只小鼠/条件的异种移植物。双向方差分析,多重比较。 e、f 来自≥3 只小鼠的 H&amp;E (e) 和天狼星红 (f) 染色的 MCF-7.shSCR 和 shCDH1 异种移植物的代表性显微照片。比例尺,200 µm。 g 箱形图显示来自 n ≥ 31 个导管、≥3 只小鼠的胶原蛋白沉积面积。方框跨越第 25 到第 75 个百分位,胡须是四分位间距的 1.5 倍。箱线图须线显示最小值和最大值。 h n = 5 对侧 MCF-7:shSCR 和 shCDH1 异种移植物的相对 mRNA 水平,5 只小鼠。配对 t 检验。 i 7 只 MCF-7 shSCR 和 8 只 MCF-7 shCDH1 荷瘤小鼠的相对微转移负担。每个点代表一个器官,虚线表示中位数,虚线表示下四分位数和上四分位数。未配对学生 t 检验。 j 对照和 MCF-7:ZEB1 异种移植物的倍数变化辐射,数据代表平均值 ± SEM,n = 16 个腺体,每个 4 只小鼠。双向方差分析,多重比较。 k,l 具有对照或 MCF-7:ZEB1 细胞的 H&amp;E (k) 和天狼星红 (l) 染色的胸腺的代表性显微照片,每组 3 只小鼠。箭头表示胸乳腺中的肌肉侵入。比例尺,200 µm。 m 显示胶原沉积面积的箱形图,n ≥ 17 个导管,≥3 只小鼠。方框跨越第 25 到第 75 个百分位,胡须是四分位间距的 1.5 倍。箱线图须线显示最小值和最大值。 n 对照和 MCF-7:ZEB1 导管内异种移植小鼠的相对微转移负担的小提琴图。虚线表示中位数,虚线表示下四分位数和上四分位数。未配对学生 t 检验。所有 mRNA 表达水平均标准化为 GAPDH 和 TBP 的几何平均值。 *、**、***、****和ns代表P<;分别为 0.05、0.01、0.001、0.0001 和不显着。

为了测试 EMP 在肿瘤进展早期是否有利于 ER+ BC 细胞的转移扩散,我们通过降低 CDH1 表达或过表达 ZEB1 来诱导 EMP。鉴于慢病毒转导的多克隆细胞群的异质性,我们预计会产生全谱的 EMP 状态。对照细胞形成具有鹅卵石形态的上皮岛,而 MCF-7:shCDH1 细胞显示出不连续生长(补充图 5d,e),减少细胞增殖(补充图 5f)并增加 ZEB1 水平。 ESR1、PGR 或 AR 的表达没有改变(补充图 5g)。 ZEB1 过表达(补充图 5h)对细胞形态和增殖具有相似的影响(补充图 5h-j),CDH1、ESR1 和 PGR 表达降低,CDH2 表达增加(补充图 5k)。因此,MCF-7:shCDH1 和 MCF-7:ZEB1 细胞都获得了最近指南定义的不同 EMP 特征。

当在导管内移植时,MCF-7:shCDH1 细胞的生长少于 MCF-7:shSCR 对照(图 4d)。终点的乳腺重量和 E-cad 表达减少(补充图 6a-c)。 H&amp;E 染色切片分析显示 MCF-7:shSCR 细胞侵入基质,而 MCF-7:shCDH1 细胞大部分保持在原位(图 4e)。 picrosirius 红染色的图像分析显示 MCF-7:shCDH1 异种移植物中纤维状胶原沉积增加,验证了实验性 CDH1 下调在体内诱导了功能性 EMT 16, 29(图 4f,g)。分子分析证实 CDH1 减少和 ZEB1 转录物增加,而其他 EMT-TF 的表达不受影响(图 4h)。

CDH1 敲低减少了细胞连接处的 p120 和 β- 连环蛋白(补充图 6d)。与 MCF-7:shSCR 移植物相比,MCF-7:shCDH1 的 Ki67 和 pHH3 指数降低,而凋亡指数增加(补充图 6e,f)。植入 MCF-7:shCDH1 细胞的小鼠的微转移负荷约为植入 MCF-7:shSCR 细胞的小鼠的 10%(图 4i 和补充图 6g)。为了排除转移负担减少仅反映原发性肿瘤生长减少的可能性,我们分析了具有相当原发性肿瘤负担的小鼠的微转移负担。在相应配对的小鼠中,MCF-7:shCDH1 细胞引起较小的微转移负荷(补充图 6h),表明 CDH1 表达降低和由此产生的 EMP 特征不会增加 ER + BC 细胞的转移倾向。

为了排除遗传上不同的肿瘤细胞对宿主的任何潜在全身影响,我们对侧移植了 MCF-7:shSCR:GFP 和 MCF-7:shCDH1:RFP 细胞(补充图 6i)。终点处植入 MCF-7:shCDH1:RFP 细胞的腺体发出的信号低于植入 MCF-7:shSCR:GFP 细胞的对侧腺体发出的信号(补充图 6j)。 shCDH1:RFP+ 肺病灶的数量少于 GFP+ 基因座的数量,总 RFP+ 面积小于 GFP+ 面积(补充图 6k,l)。这些结果再次支持 E-cad 下调与相关 EMP 特征不利于 ER+ BC 转移的假设。

类似地,MCF-7:ZEB1 异种移植物生长较少,移植腺体在四个月时的重量低于 MCF-7:Ctrl 异种移植物(图 4j,补充图 6m)。组织学显示对照细胞侵入胸腺附近的肌肉组织,而过表达 ZEB1 的细胞保持原位,偶尔有微侵袭灶(图 4k)。 MCF-7:ZEB1 中的纤维状胶原沉积物比 MCF-7:Ctrl 异种移植物大(图 4l,m)。在 ZEB1 过表达时观察到凋亡指数增加的趋势(补充图 6n)。 ZEB1 过表达降低了 E-cad、p120 和 β-Catenin 蛋白的水平,偶尔检测到 Vim+ 细胞(补充图 6o)。同样,强制 EMP 状态减少了微转移负担(图 4n,补充图 6p)。

其他 EMT-TFs 如 ZEB2、TWIST1 和 SNAI1 的过表达同样降低了肿瘤生长和转移负荷(补充图 6q,r),认为 MCF-7 细胞中通过不同方式诱导的不同 EMP 状态既不利于肿瘤进展也不利于转移。

ER+ PDXs 中的 EMP

为了评估 MCF-7 细胞中这些发现与 ER+ BC 的相关性,我们下调了 T99 和 METS15 细胞中的 E-cad 表达。体内生长(图5a)和终点的乳腺重量减少(补充图6s)。我们证实终点处异种移植腺体中 CDH1 mRNA 水平降低(图 5b)。此外,E-cad 下调减少了肿瘤侵袭(图 5c)和微转移负担(图 5d 和补充图 6t)。类似地,异位 ZEB1 表达降低了 T99 导管内生长(图 5e)、异种移植腺体的重量(补充图 6u)以及肺和骨骼中的微转移负荷(图 5f,补充图 6v)。因此,由单个基因的遗传操作诱导的 EMP 本身既不利于肿瘤进展,也不利于 ER+ BC 细胞的转移。这表明 ER+ BC 细胞是可塑性的,并且可能在细胞离开原发性肿瘤后(可能在远处部位)诱导或稳定间充质表型。

a 导管内 T99 和 METS15 shSCR 或 shCDH1 的生长曲线。数据代表 T99 的每个 shSCR 和 shCDH1 组的 16 个异种移植腺体的平均值 ± SEM,METS15 的 16 个和 20 个异种移植腺体,每个队列 5 只小鼠。双向方差分析,多重比较。 b shSCR 和 shCDH1 导管内异种移植物中的相对 CDH1 表达(T99 各 3 个,METS15 各 4 个)。数据代表平均值±SD。未配对学生 t 检验。 c T99 shSCR 和 shCDH1 异种移植腺体的代表性 H&amp;E 显微照片。比例尺,200 µm。 d T99 和 METS15 导管内异种移植小鼠的相对微转移负担的小提琴图。虚线表示中位数,虚线表示下四分位数和上四分位数。每个点代表一个器官。未配对学生 t 检验。 e 载体对照和过表达 ZEB1 的 T99 导管内异种移植物的生长曲线。数据分别代表 15 个和 18 个异种移植腺体的平均值 ± SEM。双向方差分析,多重比较。 f 来自 4 只对照和 5 只过表达 T99 异种移植物的小鼠肺和骨骼中相对微转移负荷的小提琴图。虚线表示中位数,虚线表示下四分位数和上四分位数。未配对学生 t 检验。 *、**、***、****和ns代表P<;分别为 0.05、0.01、0.001、0.0001 和不显着。

E-钙粘蛋白足以唤醒休眠

的 DTC 我们发现休眠的 DTC 至少部分处于间充质状态,这促使我们评估返回上皮状态是否可能重新激活增殖。为此,我们将植入 MCF-7:RFP 细胞的 NSG-EGFP 小鼠的乳腺和肺分离为单个细胞,将它们置于 2D 中并应用药物选择以避免小鼠细胞过度生长。源自原发性肿瘤的 RFP+ MCF-7 细胞在几天内增殖,并在 1-2 周内融合(补充图 7a)。肺源性 DTC 在 2 个月后恢复增殖并形成上皮胰岛(补充图 7b)。脑 DTCs 的 CDH1 转录水平低于肺 DTCs(图 3f),需要更长的时间才能从静止状态中出现并在 4 个月时形成上皮胰岛(补充图 7c)。 CDH1 转录物水平最终恢复,并且 EMT-TF、ZEB1、ZEB2 和 VIM 转录物在培养中连续传代后减少(补充图 7d-g),这与重新获得上皮状态使细胞增殖的假设一致。

为了解决恢复上皮状态是否足以在体内唤醒休眠的 DTC,我们在 MCF-7 细胞中过表达 E-cad(补充图 7h)。与对照相比,在导管内植入一天后,植入 MCF-7:CDH1 细胞的腺体的生物发光比对照高 2 倍,这表明 E-cad 有利于肿瘤细胞存活和/或植入小鼠乳管(图 6a)。然而,注射后六个月,MCF-7:CDH1 移植物中的生物发光比对照低 2 倍(图 6b)。与最初在体外观察到的 10 倍增加相似(补充图 7h),观察到 CDH1 转录物水平增加了 8 倍(图 6c)。来自具有MCF-7:CDH1异种移植物的小鼠的肺中的离体生物发光是携带MCF-7:Ctrl异种移植物的小鼠的10%(图6d)。然而,单个肺部病变 >在植入 MCF-7:CDH1 的 4 只小鼠中有 1 只检测到直径为 500 µm(图 6e),而在 60 多只植入亲本 MCF-7 细胞的小鼠中从未观察到如此大的病变,这表明 E-cad 表达可能克服休眠。

a 第 1 天 MCF-7 对照和 CDH1 细胞的辐射。数据代表 4、5 只小鼠的平均值 ± SD、n = 16、17 个腺体。未配对学生 t 检验。 b 辐射倍数变化。数据代表平均值 ± SEM,n = 16、17 个腺体,4 只、5 只小鼠 c MCF-7 对照和 CDH1 细胞中的相对 CDH1 mRNA 水平,n = 5。数据代表平均值 ± SD。未配对学生 t 检验。 d 离体肺辐射。数据代表来自 5 只对照和 4 只 CDH1 小鼠的平均值 ± SD。多个 t 检验。 e MCF-7 对照(上)或 CDH1(下)肺的荧光显微照片。比例尺,500 µm。 f 实验方案。 g、h 来自 -DOX 和 +DOX 小鼠的 20 个异种移植腺体的相对辐射度和重量 (g)。数据代表平均值±SD。未配对学生 t 检验。 i 在 - 或 +DOX 中的肺辐射倍数变化,数据代表平均值 ± SEM,每组 n = 16。双尾 Mann-Whitney 检验。 **p ≤ 0.01。 j 相对微转移负担。数据代表平均值 ± SEM,n = 69,来自 16 只小鼠/组。非参数 Mann-Whitney 检验。 k 来自 - 和 +DOX 小鼠的肺的代表性荧光显微照片。比例尺,500 µm。 l 定量来自-或+DOX小鼠的肺损伤面积,每只n = 9。 n≥476 病灶 9 只小鼠/条件。数据代表平均值±SD。未配对学生 t 检验。 m 来自 - 或 +DOX 小鼠的肺切片的代表性显微照片。比例尺,100 µm。 n 量化来自 - 和 + DOX 的 H&amp;E 染色肺切片中的病变长度和面积,n ≥ 30 个病变,3 只小鼠/条件。数据代表平均值±SD。未配对学生 t 检验。 ○。肺病变中 E-cad 的相对 E-cad 强度 (Int.) 和代表性 IF,来自 3 只小鼠/条件的 n ≥ 38。比例尺,50 µm。数据代表平均值±SEM。未配对学生 t 检验。 p 来自 6 -DOX 和 7 +DOX 小鼠的肺中的相对 CDH1 和 MKI67 mRNA 水平。数据代表平均值±SD。非参数 Mann Whitney 检验。 q Pearson 图显示 6 -DOX 和 7 +DOX 小鼠中 MKI67 和 CDH1 mRNA 水平之间的相关性。 r 5 -DOX 和 6 +DOX 小鼠肺中 EMT-TFs 的相对 mRNA 水平。数据代表平均值±SD。非参数 Mann Whitney 检验。所有相对 mRNA 水平均标准化为 GAPDH。

为了规避 E-cad 过表达对原发部位 MCF-7 细胞的植入和体内生长的潜在混杂影响,我们使用了强力霉素(DOX)诱导型 E-cad 表达载体(E-cadIND)(补充图 7i) .在植入 MCF-7:E-cadIND 细胞 5 个月后,当在肺中很容易检测到 DTC 时,将一组小鼠转换为含有 DOX 的食物 2-3 个月(图 6f)。在 DOX 诱导组中,处死时乳腺的生物发光和重量显着降低(P < 0.01)(图 6g,h),但肺生物发光和远处器官的整体生物发光显着增加(图 6i,j) . DOX 治疗本身不影响小鼠的体重(补充图 7j)、肿瘤生长、移植腺体的重量和终点处的微转移负担(补充图 7k-m)。因此,异位 E-cad 表达足以使 DTC 脱离休眠状态。

为了评估增加的肺生物发光是否是由于更多的播种和/或单个病变的大小增加,我们通过荧光立体显微镜和组织学测量了微转移。 CDH1 诱导增加了整体荧光面积(图 6k,l)以及肺部病变的面积和长度(图 6m,n)。 +DOX 小鼠肺微转移灶的抗 E-cad IF 信号强度比 -DOX 小鼠高 5.5 倍(图 6o)。肺上的半定量 RT-PCR 证实了 CDH1 的诱导,并显示 + DOX 组中 MKI67 转录物水平增加(图 6p)。 CDH1 表达与 MKI67 表达正相关(P < 0.001)(图 6q),支持 E-cad 恢复驱动细胞周期进入和增殖。最后,我们询问 DOX 治疗小鼠的增殖增加是否涉及间充质表型的丧失。我们注意到 CDH2 和 VIM 转录水平显着下降(图 6r),ZEB2 和 SNAI2 转录水平下降的趋势,以及未改变的 SNAI1 转录水平(图 6r)。通过半定量 RT-PCR 方法(循环阈值>37)不能可靠地检测到 ZEB1。

使用 T47D:E-cadIND 细胞的类似实验(图 6f)表明,过表达 E-cad 不会显着影响原发性肿瘤的生长和乳腺重量(补充图 7n,o),但会增加 3 倍的转移负荷(补充图.7p)。荧光立体照片的分析显示,在 E-cad 恢复后,病变的面积和荧光强度增加了 10 倍(补充图 7q-s)。因此,在两个 ER+BC 模型中,E-cad 过度表达和产生的 MET 足以使 DTC 脱离休眠状态。

ESR1 突变不足以唤醒

ESR1 突变经常发生在接受芳香酶抑制剂治疗的患者的复发中30。为了检验 ESR1 突变可能导致转移性觉醒的假设,我们异种移植了 MCF-7 细胞,其中热点突变 Y537S 或 D538G 敲入内源性 ESR1 基因座31。 ESR1Y537S 不影响原发性肿瘤生长,而 ESR1D538G 促进增殖(补充图 8a)。然而,在这两种情况下,远处器官的转移或整体转移负担都受到影响(补充图 8b,c),表明这些 ESR1 突变不足以唤醒 MIND 模型中休眠的 MCF-7 细胞。

休眠和相关途径的基因组表征

为了进一步研究休眠的退出并识别驱动它的信号,我们询问了 DTC 的转录组。我们将携带 MCF-7:RPF-Luc 导管内异种移植物的小鼠的乳腺和肺分离六个月,根据 RFP 表达对单细胞悬液进行 FACS 分类,并为 > 2,550 个原发性肿瘤生成高质量的 scRNA-seq 谱细胞和 194 个 DTC。

使用统一流形近似和投影(UMAP),我们确定了原发性肿瘤细胞的八个簇(图 7a)和 DTC 的四个簇(图 7b)。基因集富集分析 (GSEA) 揭示了一个小于 0.6% 的原发性肿瘤细胞亚群正富集 EMT 特征(图 7c),而负富集 E2F 和 MYC 靶标、MTORC1 信号传导、ER 反应、氧化磷酸化和糖酵解(图 7c)。补充图9a)。 EMT 簇 7 显示上皮/管腔基因 CDH1、EPCAM、ESR1 和 KRT18 的表达降低,VIM 和 FN1 以及休眠基因 COL3A132,33 的表达增加(图 7e)。这两个数据集是可堆叠的(图 7d),表明我们的实验程序没有引入任何主要的技术偏差。 DTC 簇 1 和 3 与来自原发肿瘤的簇 7 一致。 DTC 簇 1 和 3,以下称为“非活性簇”,同样缺乏管腔上皮标志物的表达并表达 ZEB2 和 VIM(P < 0.001)(图 7f 和补充图 9b)。 DTC 集群 0 和 2,以下称为“活动集群”,表达 CDH1、EPCAM、KRT18 和 ESR1(图 7f 和补充图 9b)。

a, b UMAP 图代表从原发性肿瘤 (a) 和肺 (b) 中分离出来的 FACS 分选的 MCF-7:RFP+ 细胞。不同细胞簇的颜色代码。 c小提琴图显示原发性肿瘤细胞簇中的“HALLMARK_EMT”基因集富集评分。每把小提琴内的箱线图描述了四分位数范围,粗点表示中位数。箱线图须线显示最小值和最大值。通过拟合广义线性混合模型并计算所有已识别细胞簇的估计边际平均值来评估统计显着性。 Tukey 方法用于评估调整后的 p 值。 d 综合 UMAP 图显示 MCF-7:从原发性肿瘤(灰色)和肺组织中分离的 RFP 细胞(根据 b 中的簇进行颜色编码)。 e-g UMAP 图代表初级 MCF-7:RFP(e)和肺 DTC(f,g)中选定转录物的水平。数字描述了图 7a 和 b 中标识的簇的质心。紫色梯度代表低、黄色梯度高基因表达。 h 岭图显示在肺 DTC 中识别的“IL6_JAK_STAT3_SIGNALING”和“TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB”标志基因集的活动与休眠簇中的归一化富集分数 (NES)。通过 Welch 的 t 检验评估统计显着性。 i UCSC 基因组浏览器屏幕截图显示了 IL6 诱导的 pSTAT3 在 CDH1 启动子和增强子区域的结合。浏览器窗口显示以黄色突出显示的区域,这些区域在 MCF-7 和 T47D 细胞中的 IL6 刺激后被磷酸化 STAT3 结合36。 *、**、***、****和ns代表P<;分别为 0.05、0.01、0.001、0.0001 和不显着。

活性簇在增殖相关途径、ER 反应、MTORC1 信号传导、糖酵解和氧化磷酸化方面具有阳性 GSEA 评分(补充图 9c)。与原发性肿瘤细胞相比,肺 DTC 中的 IHC ER 标记指数降低(补充图 9d,e),表明 ER 表达降低可能导致 ER 靶基因表达降低。簇 2 包含一些 MKI67+ 和 MCM2+ 细胞,同时对 EMT 特征进行负富集(图 7g)。非活性簇 3 增加了先前与休眠有关的基因的表达,包括 ELN、COL1A1、COL3A1、FN1、BMPR2 和 CXCL12(补充图 9f)。这些发现一起表明 DTC 具有不同程度的 EMP 和休眠,其中集群 3 代表最休眠的一个。

这些发现扩展到 METS15 的肺 DTC,其中 CXCL12、BMPR2、TGFBR2、FN1 转录物被上调,而 COL3A1 在较小程度上被上调(补充图 9g)。通过 CDH1 敲低或 ZEB1 过表达实验诱导 EMP 上调 COL3A1 和 CXCL12,而 ZEB2 过表达增加 FN1(补充图 9h)。

为了验证间充质样 DTC 在觉醒期间转变为上皮状态的假设,我们用 RNA Velocity 评估了 mRNA 表达的动态变化,它基于剪接和未剪接 RNA 分子的平衡模拟 RNA 表达的瞬时变化率 34 ,35。在主要站点,由速度矢量表示的 UMAP 中投射的细胞的方向性在亚群之间变化,其中非活动簇(7)不显示任何方向性(补充图 10a)。在肺 DTC 中,在“EMP 桥”处,非活动和活动簇之间的细胞速度矢量从间充质指向上皮簇(补充图 10b)。此外,上皮基因 CDH1、EPCAM、ESR1 和 KRT8 的相位图表明转录物诱导(补充图 10c),而间充质标志物 VIM、S100A4 和 TCF4 的相位图显示抑制(补充图 10d)进一步提供支持 ER+ 休眠 DTC 觉醒需要从间充质状态转变为上皮状态的假设。

为了深入了解控制觉醒的信号通路,我们比较了活跃和非活跃集群之间的全局基因表达。正如预期的那样,标志的 GSEA 表明,活跃人群富含 DNA 修复、氧化磷酸化、E2F 靶点、mTOR 和雌激素反应,而非活跃人群富含 EMT(补充表 4)。通过 NFκB 的 IL6/JAK/STAT3 信号传导和 TNFα 信号传导在活性簇中呈正富集(图 7h),表明可能来自微环境的细胞因子信号传导触发了肿瘤细胞的觉醒。事实上,IL6 诱导的 STAT3 激活增加了 T47D 导管内异种移植小鼠的转移负担。来自 MCF-7 和 T47D 细胞的 pSTAT3 ChIP-Seq 数据分析显示 IL6 诱导的 pSTAT3 与 CDH1 和 ESR1 调节区结合(图 7i 和补充图 11a、b),这与 E-cad 是可以确定觉醒的STAT3激活(图8)。

ER+ 肿瘤细胞从原位进展到侵袭阶段,呈上皮状态,其特征是 E-cad 高表达和 EMT-TF 低表达。在远程站点,DTC 显示 EMP 特征并进入休眠状态。从休眠中唤醒涉及恢复 E-cad 表达,这可能由细胞因子触发,导致 STAT3 激活和 EMT-TF 抑制。促进 EMP 或抑制上皮状态重新获得的药物可预防疾病复发。EMT-TFs 上皮-间质转化激活转录因子、EMP 上皮-间质可塑性、DTCs 播散性肿瘤细胞。

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